В ходе выполнения проекта на участке массового ветровала в смешанном широколиственном лесу были отобраны образцы древесины для метагеномного анализа валежа восьми видов деревьев: Quercus robur, Fraxinus excelsior, Tilia cordata, Ulmus glabra, Acer platanoides, Populus tremula, Betula pendula и Picea abies. С соблюдением условий стерильности из лежащих стволов каждого вида дерева было взято и в замороженном состоянии доставлено в лабораторию не менее трех смешанных образцов на каждой из пяти стадий разложения древесины.
Параллельно был проведен ДНК-баркодинг образцов плодовых тел ксилобионтных афиллофороидных грибов, собранных в местах сбора образцов древесины для метагеномного анализа. Были получены 60 новых нуклеотидных последовательностей ITS1–5.8S–ITS2 области ярДНК, из которых для 20 последовательностей была депонирована информация в международную базу данных NCBI GenBank. Впервые полученные и депонированные в NCBI GenBank полные нуклеотидные последовательности ITS1–5.8S–ITS2 ярДНК представлены преимущественно таксонами, о которых ранее отсутствовала информация в референсных базах данных, что осложняло их выявление при проведении метагеномных исследований древесных субстратов. Получены нуклеотидные последовательности из аутентичных образцов для малоизвестных и редко обнаруживаемых в природе видов грибов. Создана локальная база референсных последовательностей ДНК макромицетов, в которой для каждой нуклеотидной последовательности приведена информация о методе выделения ДНК, использованных праймерах, а также подробные сведения о ваучерном гербарном образце. В GBIF опубликована информация по 146 находкам афиллофороидных грибов на исследованных участках массового ветровала.
Были проанализированы физические и химические характеристики образцов древесины, собранных на тех же стволах 8 видов деревьев (Ханина и др., 2023а; Khanina et al., 2023a, b). Характеристики 247 образцов на 5 стадиях деструкции выложены в GBIF. Проведенный анализ выявил, что в ходе деструкции древесины стволов происходит значимое увеличение концентраций N, Mn, P, Cu, Zn и Ca (Рис. 1). Значимые отличия по содержанию и массовой концентрации между валежной древесиной разных видов выявлены для C, Mn, Zn, Mg, Ca и K. Лидерами по содержанию этих элементов оказались следующие виды: C - ель и липа, Mn – клен, береза, ель, липа; Zn – береза и осина; Mg – клен, вяз; Ca – вяз; K – липа, вяз. Выявлено, что за 14 лет после массового ветровала произошло снижение запасов валежа в 1.5 раза при снижении запасов элементов в валеже в 1.7–2.5 раза для N, Mg и K и 2.7–3.5 раза для C, P и Ca (Ханина и др., 2023б). Установлена более высокая скорость разложения лиственных видов с рассеянно-сосудистой древесиной (береза, осина, клен, липа) по сравнению с лиственными видами с кольцесосудистой древесиной (дуб, ясень, вяз). Хвойный вид ель по скорости разложения занимает промежуточное положение между лиственными видами указанных групп.
Рис. 1. Ординация химических характеристик образцов древесины методом главных компонент (PCA): Group1 – группа лиственных видов с кольцесосудистой древесиной (дуб, вяз, ясень); Group 2 – группа лиственных видов с рассеянно-пористой древесиной (осина, береза, липа, клен); Group 3 – хвойный вид ель. Stage _0 – образцы древесины, взятые у живых деревьев, Stage_1… Stage_5 – образцы на стадиях разложения от минимальной (1) до максимальной (5).
Для выполнения метагеномного анализа была проведена оптимизация протокола выделения суммарной ДНК и амплификации вариабельных участков ITS грибов. Была выделена метагеномная ДНК (Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Kit) из 144 образцов древесины 8 видов на 5 стадиях разложения. Были амплифицированы вариабельные участки 16S рРНК бактерий (V4) и ITS грибов (ITS1-2). Полученные библиотеки были отсеквенированы в ЦКП Геномики Сколковского института науки и технологи. Таксономическую классификацию вариантов последовательностей ампликонов (ASV) проводили на основе баз данных SILVA (Kim et al., 2019) и UNITE (Nilsson, 2019) с привлечением эталонных последовательностей, полученных путем секвенирования (по Сэнгеру) плодовых тел макромицетов, собранных на исследуемых участках ветровала.
Из образцов всего было получено 4717 различных вариантов последовательностей ITS1 грибов и 92262 вариантов последовательностей регионов V4 гена 16S rRNA бактерий. После даунсэмплирования осталось около 2500 и 22500 уникальных последовательностей в сообществах грибов и бактерий, соответственно. У всех видов деревьев наблюдалось увеличение альфа-разнообразия грибного и бактериального сообществ между начальными и конечными стадиями разложения, на всех стадиях разложения бактериальное сообщество было более разнообразно, чем грибное. На первых стадиях грибное сообщество состояло в среднем из примерно 25 видов на вид (кроме ели) с ярко выраженными доминантными представителями. Бактериальное сообщество каждого древесного вида состояло, как правило, из более 200 видов (кроме клена и березы). К четвертой и пятой стадии разложения у всех видов деревьев в среднем наблюдалось более 100 видов грибов и от примерно 400 до более 600 видов бактерий. У некоторых видов деревьев наблюдался спад разнообразия исследуемых деструкторов на второй или третьей стадии разложения. Концентрация ампликонов от бактериальных сообществ на последней стадии разложения чаще была выше, чем на первой, а у грибного сообщества часто наблюдался пик на более ранних стадиях (1-3) и спад на последней. По нашим данным, максимальная концентрация грибов и бактерий была характерна для липы, а минимальная - для дуба. В древесине дуба бактерии в заметном количестве появлялись только к третьей стадии разложения, что, вероятно, коррелирует с его устойчивостью к разложению и, как следствие, активным использованием в хозяйстве.
Сообщество грибов характеризовалось очень высоким бета-разнообразием, при этом расстояние между образцами разных древесных видов одной стадии разложения оказалось немного меньше, чем расстояние между образцами одного вида, но разных стадий, в результате чего наблюдалась более выраженная кластеризация образцов по стадии разложения, чем по виду дерева. В ходе разложения древесины грибное сообщество для некоторых древесных видов резко изменялось, демонстрируя смену доминантных представителей на уровне филума. Большинство родов грибов наблюдалось только на образцах одного вида одной стадии.
В бактериальном сообществе также наблюдалось очень высокое бета-разнообразие при оценке по расстоянию Брея-Кёртиса. По сходству сообществ бактерий (как и грибов, но для бактерий в большей степени) образцы кластеризовались более по стадиям, чем по древесным видам (Рис. 2).
Рис. 2. Ординация бактериальных сообществ образцов с помощью метода главных координат (PCoA). На рисунке представлены образцы всех исследованных видов деревьев. Разными цветами обозначены стадии разложения. На осях отмечены проценты объяснённой дисперсии. (Из Волобуев и др., 2023).
По учету плодовых тел афиллофороидных грибов, на валежных стволах 8 видов деревьев было выявлено 127 видов базидиальных грибов. Максимальное видовое богатство отмечено на валежных стволах ели (46 видов). Грибы белой гнили доминировали (74%), грибы бурой гнили составляли 19%. Стволы разных видов деревьев значимо не отличались по числу видов грибов, найденных на них. Состав базидиомицетов на стволах валежин разных видов деревьев достаточно хорошо различался, что показали результаты NMDS и PERMANOVA. Видовая принадлежность стволов деревьев определяла 45% вариации видового состава базидиомицетов. Аддитивное разбиение биоразнообразия показало, что вклады всех составляющих разнообразия являлись значимыми, но максимальный вклад (81%) в общее гамма-разнообразие базидиомицетов вносило композиционное разнообразие между видами деревьев, которое было статистически значимо выше, чем ожидаемое при нулевой модели.
Таким образом, в целом мы получили соответствующие друг другу оценки разнообразия сообществ грибов, выявленных по плодовым телам и результатам метагеномного анализа. Два вида анализа показали увеличение разнообразия сообществ с увеличением стадии разложения и важность вклада разнообразия древесного субстрата в общее гамма-разнообразие грибного населения анализируемого участка. Метагеномный анализ позволил детально оценить количественное и качественное изменение видового разнообразия сообществ деструкторов (бактерий и грибов) в ходе разложения древесины различных видов деревьев; предположить специфические особенности изменения разнообразия в процессе разложения для каждого из восьми анализируемых древесных видов.
Результаты исследования представлены на 9 научных конференциях. Опубликовано 14 статей, среди них 3 в журналах, регистрируемых в БД WoS (Q1, Q3) и Scopus; 8 в сборниках материалов конференций и 3 набора данных.
Литература
- Khanina, L., Bobrovsky, M., Smirnov, V., Romanov, M. Wood decomposition, carbon, nitrogen, and pH values in logs of 8 tree species 14 and 15 years after a catastrophic windthrow in a mesic broad-leaved forest in the East European plain // Forest Ecology and Management. 2023a. Vol. 545. ID 121275. https://doi.org/10.1016/j.foreco.2023.121275
- Khanina, L.G., Smirnov, V.E., Bobrovskii, M.V. The elemental composition of dead wood in different tree species and stages of decay in the broad-leaved forests of the Kaluzhskie Zaseki State Nature Reserve // Russian Journal of Ecology. 2023b. Vol. 54. No. 7. P. 658–670. https://doi.org/10.1134/S106741362307007X
- Ханина Л.Г., Смирнов В.Э., Бобровский М.В. Влияние древесной породы и стадии разложения на элементный состав валежа в широколиственном лесу на Восточно-Европейской равнине // Лесоведение. 2023а. № 4. С. 353-368. https://doi.org/10.31857/S0024114823040034
- Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Смирнов В.Э. Динамика запасов биофильных элементов в валеже и почве после массового ветровала в широколиственном лесу на флювиогляциальных песках // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2023б. № 62. С. 29–52. https://doi.org/10.17223/19988591/62/2
- Волобуев С., Шелякин П., Тутукина М., Бессонова Т., Бобровский М., Ханина Л. Метагеномный анализ ксилобионтных грибов и бактерий в валежных стволах лиственных и хвойных деревьев разной степени разложения после массового ветровала в полидоминантном широколиственном лесу // Proceedings of 11th Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'23. 2023. М.: ИППИ РАН. 158.
