Основными задачами проекта являются: (1) идентификация операционных таксономических единиц (OTU) или вариантов последовательностей ампликонов (ASV) микромицетов и бактерий в почвенных образцах, отобранных под валежом разных видов деревьев и в фоновых почвах широколиственных лесов, расположенных в экотопах флювио-гляциальных песков и покровных суглинков, (2) анализ физико-химических и общих микробиологических характеристик почв, отобранных под валежом разных видов деревьев и в фоновых почвах широколиственных лесов, расположенных на песках и суглинках и (3) оценка видового и функционального разнообразия почвенных грибов и бактерий и анализ взаимосвязей разнообразия и состава микробиоты с почвенными характеристиками и местами взятия почвенных проб (в фоновом лесу, на ветровальном участке, под валежом разных видов деревьев, в разных типах почв).
В 2024 г. были проведены полевые работы в заповеднике «Калужские засеки» в экотопах флювио-гляциальных песков и покровных лёссовидных суглинков. Почвенные образцы были отобраны на двух участках массового ветровала 2006 года (на песках и на суглинках, рядом с деревнями Ягодное и Нагая, соответственно) и в двух типах почв (в дерново-подзолистых с пятнами серых лесных и в темногумусовых) на участке старовозрастного леса на суглинках (бывш. 8 кв. Ягодненского лесничества) (Рис. 1, 2).
Для исследования метагенома отбор почв проводили из верхних 5 см минерального горизонта А без подстилки в стерильные пакеты стерилизованной ложкой, которую обрабатывали спиртом и обжигали. После транспортировки из леса (не более чем через 3 часа после отбора) образцы замораживали в морозильной камере на стационаре заповедника. Транспортировку образцов до лаборатории осуществляли в кулере с хладоагентами. Во всех местах отбора проб на метагеномные исследования были также взяты образцы для анализа физических и химических свойств почвы. Отбор проводили под упавшими стволами деревьев и на площадках вне стволов в трехкратной повторности: на участке массового ветровала на песках под стволами пяти видов Quercus robur, Tilia cordata, Acer platanoides, Populus tremula и Picea abies; на участке массового ветровала на суглинках под стволами четырех видов Fraxinus excelsior, Ulmus glabra, Acer platanoides и Picea abies и на участке старовозрастного леса в двух типах почв под стволами Quercus robur (Рис. 3). Всего для метагеномного анализа отобрано 63 почвенных образца.
Рис. 1. Район исследований (А, красный квадрат) и точки исследования (Б, красные окружности) на Южном участке заповедника «Калужские засеки»: 1 – старовозрастный лес (более 200 лет) с единичными ветровалами на темногумусовых и дерново-подзолистых почвах, 2 – массовый ветровал 2006 г. в широколиственном лесу (70 лет) на дерново-подзолистых почвах, 3 – массовый ветровал 2006 г. в широколиственном лесу (95 лет) на подзолах. Черные пятна – участки поваленного древостоя при массовом ветровале 2006 г.
Рис. 2. Растительность на участках исследования: А и Б – единичные ветровалы в старовозрастном широколиственном лесу на темногумусовых и дерново-подзолистых почвах, В и Г – массовый ветровал 2006 г. на подзолах и дерново-подзолистых почвах в 2020 и 2021
Рис. 3. Места отбора образцов почв: А и Б – под валежом дуба в старовозрастном лесу на темногумусовых и дерново-подзолистых почвах; В и Г – на участках массового ветровала на дерново-подзолистой почве (под валежом ясеня) и на подзоле (под валежом ели)
Из почвенных образцов выделена суммарная ДНК с использованием набора Qiagen DNAeasy PowerSoil Pro (Qiagen, Германия). Проведена амплификация фрагментов вариабельного участка ITS3-ITS4 грибов и участка V4 16S рРНК бактерий с использованием Q5 (NEB) полимеразы. Количественная оценка выделенной ДНК и измерение концентрации ампликонов проведены при помощи спектрофлуориметра Qubit с использованием наборов Qubit BR и HS 1X Assay Kit (Invitrogen, США). Полученные ампликоны будут использованы для приготовления библиотек и секвенирования на платформе Illumina MiSeq.
Амплификация прошла успешно, концентрации ампликонов в целом оказались достаточны для дальнейшей подготовки библиотек. В целом в образцах, взятых под стволами, концентрации и грибов, и бактерий были значимо ниже, чем в образцах, взятых на участках, свободных от лежащих стволов. Этот предварительный вывод согласуется с результатами, полученными нами ранее для микробной активности почв (Ханина и др., 2022; Khanina et al., 2024; Смирнов и др., 2024), которая уменьшалась под стволами на суглинистых почвах. Концентрации бактерий и грибов между образцами изменялись в целом согласованно: при увеличении / уменьшении концентраций бактерий наблюдалось увеличение / уменьшение концентраций грибов. Наибольшие концентрации микроорганизмов наблюдались в дерново-подзолистых почвах на суглинках, наименьшие – в подзолах на песках.
В ходе выполнения проекта проанализированы характеристики почвы на участке массового ветровала на суглинках: исследовались физические, химические и микробиологические характеристики, запасы C и N под лежащими стволами деревьев разных видов, рядом с этими стволами и в фоновом лесу вне участка массового ветровала (Khanina et al., 2024). Показано, что на покровных лессовидных суглинках содержание и запасы C, N, микробная активность (углерод микробной биомассы и микробное дыхание), влажность почвы максимальны на участке массового ветровала, свободном от лежащих стволов. Запасы C, N и микробная активность выше на ветровале, чем в фоновом лесу. При этом вид упавшего дерева не влияет на почвенные характеристики. Характеристики почвы под лежащими стволами близки к оценкам фонового леса. На участке старовозрастного леса почва разных типов (дерново-подзолистая и темногумусовая) не различалась по микробной активности, но значимо различалась по содержанию N, C, отношению C/N, содержанию подвижных форм P и К; эти характеристики были выше в темногумусовых почвах. Микробная активность почв значимо падала под валежом, также как содержание C и водородный показатель pH (Ханина и др., 2024; Смирнов и др., 2024).
Результаты исследования доложены на 5 конференциях. Опубликована статья в журнале Eurasian Soil Science, статья в продолжающемся издании, один набор данных, 4 статьи в материалах конференций. Выпущен пресс-релиз о проекте «Упавшие деревья – кладовая леса» в газете Поиск, на сайте РНФ и других СМИ.
