Лаборатория вычислительной экологии

Руководитель: Ханина Л.Г. https://orcid.org/0000-0002-8937-5938.
Исполнители: Савельев Д.С. https://orcid.org/0009-0009-0420-1532, Волобуев С.В. https://www.binran.ru/sotrudniki/4936/.

Для сравнительного исследования разнообразия бактериальных и грибных сообществ почвы в широколиственном лесу после ветровалов были отобраны образцы из верхнего 5 см слоя почвенного горизонта А в 4х биотопах заповедника “Калужские засеки”: на двух участках массового ветровала 2006 г. - (1) в 100-летнем лесу на песчаных дерново-подзолах (Podzols, PZ) и (2) 70-летнем лесу на суглинистых дерново-подзолистых почвах (Retisols, Ret_N), а также в двух вариантах суглинистых почв на участке старовозрастного леса с единичными ветровалами и дубами более 300 лет - (3) на дерново-подзолистых (Retisols, Ret_T) и (4) темногумусовых (Phaozems, PH) почвах (см. Отчет 2024). Образцы отбирали под плотно лежащими на почве валежными стволами средней стадии разложения, а также на участке массового ветровала без лежащих стволов и в фоновом лесу не менее, чем в трехкратной повторности на участок (биотоп-сайт) с учетом вида дерева лежащего ствола (всего 63 образца). Почва отобрана под валежом 7 видов деревьев: клен остролистный (Acer platanoides), ясень обыкновенный (Fraxinus excelsior), осина обыкновенная (Populus tremula), липа мелколистная (Tilia cordata), вяз шершавый (Ulmus glabra), дуб черешчатый (Quercus robur), ель европейская (Picea abies). Отбор почвы проводили стерилизованными приборами в стерильные пакеты, замораживали при t -20°C и транспортировали до лаборатории в кулере без размораживания.

Из каждого почвенного образца выделяли тотальную ДНК. С использованием стандартных праймеров амплифицировали вариабельные участки V4 16S рРНК бактерий и ITS грибов. Далее были созданы библиотеки ДНК, которые были отсеквенированы в ЦКП геномики Сколтеха на Illumina MiSeq (Illumina, США). Также было определено относительное содержание бактериальной и грибной ДНК в 63 образцах путем проведения количественной ПЦР на приборе DT-lite (ДНК-Технология, Россия).

После секвенирования выполняли биоинформатический анализ сообществ грибов и бактерий. Качество полученных прочтений анализировали с помощью программы FastQC (Andrews, 2010). Анализ данных секвенирования проводили с помощью QIIME2 (Bolyen et al., 2019). Коррекцию ошибок секвенирования, объединение парных прочтений, отсеивание химерных последовательностей и построение таблицы вариантов последовательностей ампликона проводили с помощью пакета DADA2 (Callahan et al., 2016). Параметры фильтрации подбирали так, чтобы терять минимальное количество прочтений и получить большее число прочтений в образцах на этапе определения таксономической принадлежности. Три образца для бактерий и 6 образцов для грибов имели меньше 10 прочтений; они были исключены из дальнейшего анализа. Для бактерий среднее количество прочтений в образцах до фильтрации составляло примерно 35000 (минимум - 8000, максимум - 105000); в среднем 43% прочтений проходили все этапы фильтрации в DADA2, среднее количество прочтений после фильтрации составило около 15000. Для грибов среднее количество прочтений в образцах до фильтрации составляло примерно 38500 (минимум - 16000, максимум - 90000); в среднем 61% прочтений проходили все этапы фильтрации в DADA2, среднее количество прочтений после фильтрации составило около 24300. Полученные таблицы вариантов последовательностей ампликонов (ASV) анализировали с помощью пакета phyloseq (McMurdie, Holmes, 2013). Таксономические принадлежности вариантов последовательностей ампликонов (ASV) были определены для бактерий на основе референсных последовательностей из базы данных GreenGenes2 (McDonald et al., 2024), а для грибов с помощью классификатора в базе данных UNITE (Abarenkov et al., 2024). Всего в почвенных образцах обнаружено 19287 уникальных ASV бактерий (60 образцов) и 1565 ASV грибов (57 образцов).

Рассчитывали метрики альфа и бета-разнообразия. Проверяли гипотезы, что на содержание и разнообразие почвенных микробных сообществ влияют (1) гранулометрический состав почв и биотопы, (2) массовый ветровал, включая лежащие стволы и участки вне валежа, в сравнении с фоновым лесом без валежа; (3) лежащие стволы деревьев при сравнении с участками вне валежа и (4) видовая принадлежность валежных стволов. Оценивали значимость различий относительного содержания ДНК, индексов альфа-разнообразия и состава ASV бактерий и грибов между группами образцов путем проведения анализов ANOVA и PERMANOVA.

Результаты метагеномных исследований

Относительное содержание ДНК бактерий было выше в образцах, взятых в суглинках, чем в образцах, взятых в песках, и наоборот, содержание ДНК грибов было выше в песках: число циклов удвоения ПЦР для получения детектируемого сигнала ДНК как грибов (Ct_ITS), так и бактерий (Ct_V4) значимо различалось в образцах разного гранулометрического состава (R2 = 0.63 и 0.48, P < 0.001) (Рис. 1). Относительное содержание ДНК бактерий было ниже в образцах, взятых под стволами, чем в образцах, взятых на участках, свободных от лежащих стволов. Максимальное содержание ДНК бактерий наблюдалось в темногумусовых почвах старовозрастного леса на участках без валежа (PH, Forest). Относительное содержание ДНК грибов было максимальным в подзолах под валежом (особенно под стволами ели – PZ, Picea) и минимальным в суглинках (Ret_N, Ret_T, PH).

Профилирование микробных сообществ при помощи секвенирования 16S рРНК показало, что изученные почвы 70-, 100- и более чем 300-летних лесов отличаются высоким обилием групп бактерий, участвующих в циклах углерода, азота, фосфора, серы, а также функционировании ризосферы. Основная группа бактерий в исследованных лесах – Alphaproteobacteria, прежде всего порядок Rhizobiales, представители которого ассоциированы с ризосферой и играют важную роль в азотном цикле (Рис. 2). Состав доминирующих классов – преобладание Alphaproteobacteria и Verrucomicrobiae, а также Planctomycetia в песчаных почвах, – отличает почвы заповедника “Калужские засеки” от большинства других исследованных лесных почв в литературе, прежде всего небольшой долей ацидобактерий и актиномицетов.

Профилирование грибных сообществ путем секвенирования участка ITS показало, что заметная особенность этих сообществ – абсолютное доминирование аскомицетов при очень малом участии других филумов (Рис. 3). В фаоземах и ретисолях преобладают сапрофиты. Эктомикоризные грибы доминируют только в фоновом лесу на подзолах, в почвах остальных сайтов на подзолах их доля также значительна, при этом преобладает Cenococcum, наиболее распространенный монотипный род микоризообразующих грибов. Наибольшее богатство грибных ASV отмечено для сообществ фаоземов, здесь же отмечено минимальное число доминирующих родов: Penicillium, Oidiodendron и Helotiales, что означает высокое внутриродовое разнообразие этих сообществ.

По структуре сообществ, разнообразию и содержанию бактериальной и грибной ДНК наиболее существенные различия отмечены между сообществами в почвах разного гранулометрического состава: в песках (дерново-подзолы) и суглинках (ретисоли и фаоземы). Несмотря на более высокое относительное содержание ДНК грибов в песчаных почвах, в суглинистых почвах значимо выше альфа-разнообразие сообществ и бактерий, и грибов (Рис. 4, 5). Результаты подтвердили гипотезу о значимом влиянии валежной древесины на микробные сообщества лесных почв. Влияние на бактериальное сообщество очень разнообразно, оно зависит как от свойств почв, так и от вида упавшего дерева. Вместе с тем, структура бактериальных сообществ по высокочастотным порядкам довольно консервативна и не сильно варьирует между сайтами в пределах биотопа. Наиболее заметны изменения в составе сообществ под валежом деревьев с особыми свойствами древесины (Quercus robur, Picea abies, Acer platanoides – в частности, низкий уровень pH у дуба и ели и высокий у клена). Для грибных сообществ средние значения альфа-разнообразия под валежом по сравнению с фоном оказались ниже в суглинистых почвах и выше в песчаных почвах. Под валежом и на участках массового ветровала без валежа наблюдали большое число уникальных таксонов, составляющих более половины общего числа определенных в работе ASV.

Физические и химические характеристики почв на ветровалах Характеристики почвы на ветровальных участках также были проанализированы в ходе выполнения проекта. На участке массового ветровала на суглинках исследовались физические, химические и микробиологические характеристики, запасы C и N под лежащими стволами деревьев разных видов, рядом с этими стволами и в фоновом лесу вне участка массового ветровала (Khanina et al., 2024). Показано, что на покровных лессовидных суглинках содержание и запасы C, N, микробная активность (углерод микробной биомассы и микробное дыхание), влажность почвы максимальны на участке массового ветровала, свободном от лежащих стволов. Запасы C, N и микробная активность выше на ветровале, чем в фоновом лесу. При этом вид упавшего дерева не влияет на почвенные характеристики. Характеристики почвы под лежащими стволами близки к оценкам фонового леса. На участке старовозрастного леса с единичными ветровалами почва разных типов (дерново-подзолистая и темногумусовая) не различалась по микробной активности, но значимо различалась по содержанию N, C, отношению C/N, содержанию подвижных форм P и К; запасам C и N (Рис. 6); эти характеристики были выше в темногумусовых почвах. Микробная активность почв значимо падала под валежом, также как содержание C, N и водородный показатель pH (Khanina et al., 2024; Смирнов и др., 2024).

Для всех биотопов на участках массового и единичных ветровалов оценивали также эффект лежащих стволов на гранулометрический состав почв (Khanina, Bobrovsky, 2024). Анализ проводили для 18 образцов песчаных и 50 образцов суглинистых почв. Путем проведения серии однофакторных дисперсионных анализов (ANOVA) оценивали влияние вариантов почвы, участков и места взятия пробы (под и рядом с валежом) на фракции почвы: песок – размером более 0.05 мм, пыль – размером от 0.001 до 0.05 мм и ил – фракции мельче 0.001 мм. Сравнение почвенных фракций между микросайтами показало, что доля песка значимо уменьшалась, а доля пыли значимо увеличивалась под валежом во всех вариантах почв разного гранулометрического состава – как в песчаных, так и в суглинистых (Рис. 7). Этот эффект особенно заметен для крупных бревен, тогда как для мелких бревен он не наблюдался вовсе. Доля ила значимо увеличилась под валежом в старовозрастном лесу, в то время как на участках массового ветровала она существенно не различалась.

Заключение

Исследования показали, малонарушенный лес с разновозрастным древостоем и большим количеством валежа существенно богаче по запасам элементов в почве участков массового ветровала за счет высокой мощности гумусового горизонта, хотя содержание и запасы C и N в почве значимо уменьшаются под лежащими стволами на суглинках. Наличие валежа разных видов деревьев и ветровалы, ведущие к изменению экологических условий, принципиально увеличивают бактериальное и грибное разнообразие лесных почв. Создание многовидовых лесных насаждений, включающих крупные древесные остатки и древостой разного возраста, способствуют повышению способности лесов к секвестрации углерода, сохранению биоразнообразия и реализации принципов низкоуглеродной экономики. При планировании лесохозяйственных мероприятий важно ограничивать удаление крупного валежа и поддерживать разновозрастную структуру древостоя, т.к. эти элементы повышают устойчивость леса к изменению климата и способствуют долгосрочному накоплению углерода.

Результаты исследования доложены на восьми конференциях. Опубликовано (принято в печать) 6 научных статей. Выпущен пресс-релиз о проекте «Упавшие деревья – кладовая леса» в журнале Поиск, на сайте РНФ.

Публикации

• Khanina L.G., Ivashchenko K.V., Smirnov V.E., Bobrovskii M.V. Carbon and nitrogen stocks and microbial activity of the humus horizon of loamy soils after mass windthrow in the broadleaved forest of the Kaluzhskie Zaseki Nature Reserve // Eurasian Soil Science. 2024. V. 57. No. 11. P. 1806–1818. DOI: 10.1134/S1064229324601720 [Ханина Л.Г., Иващенко К.В., Смирновa В.Э., Бобровский М.В. Запасы углерода и азота, микробная активность гумусового горизонта суглинистых почв после массового ветровала в широколиственном лесу заповедника “Калужские засеки” // Почвоведение. 2024. № 11. С. 1488–1502. DOI: 10.31857/S0032180X24110046]
• Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Смирнов В.Э. Запасы углерода и азота в валеже и почве после единичных и массовых ветровалов в широколиственных лесах заповедника «Калужские засеки» // Лесоведение. 2025. № 5. С. 576–591. DOI:10.31857/S0024114825050.
• Khanina L., Bobrovsky M. Changes in soil texture under deadwood in broad-leaved forests // Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2024. V. 9. No. 4. DOI: 10.21685/2500-0578-2024-4-1
• Савельев Д.С., Шелякин П.В., Тутукина М.Н., Бессонова Т.А., Бобровский М.В., Ханина Л.Г. Влияние валежных стволов разных видов деревьев на содержание и разнообразие почвенных бактерий в широколиственных лесах заповедника «Калужские засеки» // Молекулярная биология. 2026. Т. 60. № 4.
• Khanina L.G., Bobrovsky M.V., Smirnov V.E. Carbon and nitrogen stocks in deadwood and soil after mass and isolated windthrows in broadleaved forests of the Kaluzhskie Zaseki Nature Reserve // Russian Journal of Ecology. 2026. Vol. 56. No. 6.
• Смирнов В.Э., Ханина Л.Г., Иващенко К.В., Бобровский М.В. Оценка влияния крупных лежащих стволов дуба на свойства почв на основе статистических моделей со смешанными эффектами // Доклады Международной конференции “Математическая биология и биоинформатика”. Под ред. В.Д. Лахно. Том 10. Пущино: ИМПБ РАН, 2024. Статья № e52. DOI: 10.17537/icmbb24.54.
• Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Смирнов В.Э., Романов М.С. Динамика запасов углерода в валеже и почве после ветровалов в старовозрастном широколиственном лесу // Всероссийская научная конференция, посвященная памяти академика Г.А. Заварзина «Биогенный и абиогенный циклы углерода во времени и пространстве и масштабы воздействия на них антропогенных факторов». М.: ПИН РАН. С. 83-84.
• Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Романов М.С., Смирнов В.Э., Иващенко К.В., Волобуев С.В., Шелякин П.В., Бессонова Т.А., Тутукина М.Н. Разложение валежа в широколиственном лесу. Скорости, динамика деструктуров, влияние на почву // Вопросы геологии и комплексного изучения экосистем Восточной Азии. Седьмая Всерос. науч. конф. с междунар. участием : сб. докладов. Благовещенск: ИГиП ДВО РАН, 2024. С. 225–227.
• Бессонова Т.А., Тутукина М.Н., Шелякин П.В., Бобровский М.В., Ханина Л.Г. Оценка эффективности наборов для выделения метагеномной ДНК из лесных почв // Геномика, метагеномика и молекулярная биология микроорганизмов. Сборник тезисов III Международной конференции М.: РУДН, 2025. С. 91–93.
• Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Смирнов В.Э. Запасы биофильных элементов в суглинистых почвах под и рядом с валежом дуба черешчатого // Почва как компонент биосферы: актуальные проблемы в условиях изменений климата. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 120-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР В.А. Ковды / ИФХиБПП РАН. – Пущино: 2024. С. 42–43.
• Савельев Д.С., Тутукина М.Н., Бессонова Т.А., Шелякин П.В., Бобровский М.В., Ханина Л.Г. Оценка содержания бактерий и грибов в образцах песчаных и суглинистых почв после ветровалов в широколиственном лесу // Сборник тезисов 12-й Московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (МССМВ). М.: Сколтех. 2025. С. 565–567.
• Ханина Л.Г., Савельев Д.С., Тутукина М.Н., Шелякин П.В., Бесонова Т.А., Волобуев С.В., Бобровский М.В. Изменение сообществ почвенных грибов и бактерий под валежными стволами в широколиственном лесу после ветровалов // Экологические функции лесных почв и биоразнообразие лесов. XI Всероссийская научная конференция с международным участием. Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН, г. Красноярск (2025).